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RICERCHE ministeriali - Anno 2011

Titolo Progetto:
Indagine sulla prevalenza della Leptospirosi nella fauna selvatica della Sardegna

N. identificativo: IZS SA 02/11 RC      Durata: 24 mesi
Committente: Ministero della Salute
Tipologia: Ricerca Corrente      Ruolo IZSSA: Capofila     Finanziamento €: 85.000
Responsabile:
Dr. ssa Ponti M. Nicoletta
Abstract
La leptospirosi è una malattia infettiva di origine batterica causata da un batterio del genere Leptospira segnalata in oltre 150 specie di mammiferi e diffusa in tutto il mondo; colpisce molte specie di mammiferi selvatici, domestici e l’uomo per via diretta o indiretta. Recentemente è stato dimostrato che le Leptospire patogene sono in grado di infettare anche volatili, rettili, anfibi e virtualmente artropodi. E’ considerata una malattia emergente o riemergente in considerazione dei  numerosi focolai che hanno interessato negli ultimi anni diversi Paesi dell’America Latina, dell’Asia e degli Stati Uniti. L’Organizzazione Mondiale della Sanità stima che annualmente vengono riportati oltre un milione di casi umani e, di questi, una percentuale compresa tra il 5 e il 20% sono a decorso fatale. Gli obiettivi della ricerca consistono nell’individuazione di aziende zootecniche campione in cui posizionare trappole per la cattura di specie animali selvatiche, effettuando prelievi di sangue mediante puntura cardiaca su cinghiali abbattuti durante le stagioni venatorie e prelievi di organi di elezione, quali fegato e rene, da inviare al laboratorio. Si procede con l’applicazione del “MicroscopicAgglutination Test” (MAT), ancora oggi considerato come test  “gold standard” sui campioni sierologici, accompagnato da un protocollo diagnostico colturale e biomolecolare che prevede, nel primo l’isolamento di  Leptospire in opportuni terreni (EMJH) a partire da campioni di sangue, liquido cefalorachidiano, urine e omogenati di organi e/o tessuti (post-mortem) e nel secondo, la ricerca di DNA nei medesimi campioni biologici, mediante applicazione di tecniche biomolecolari quali PCR (Polymerase Chain Reaction) end point e real-time PCR. Gli isolati vengono sottoposti poi a tipizzazione mediante indagini VNTR (VariableNumber Tandem Repeats).Nel periodo oggetto del nostro studio sono stati esaminati un totale di 7608 campioni di sangue,  di cui 24 di cervo (Cervuselaphuscorsicanus), 4 di daino (Dama dama), 49 di muflone (Ovisgmelinimusimon), 1 di nutria (Myocastorcoypus), 17 di ratto (Rattusrattus), 1 di volpe (Vulpesvulpesichnusae) e 7512 di cinghiale (Sus scrofa meridionalis) (98,7%) prelevati post mortem durante 2 stagioni venatorie. Anticorpi sono stati evidenziati in 902 campioni (11,86%) ed i sierotipi maggiormente riscontrati sono stati in ordine decrescente di prevalenza, L. Pomona, L. Bratislava e L. Grippotyphosa. Sono stati collezionati ed esaminati con la prova colturale 466 campioni di organi, il 99% dei quali rappresentati da reni; di questi, il 54% sono stati prelevati da cinghiale, il 26 % da soggetti appartenenti alla famiglia dei Muridae, il 10% da volpe, il 3% da riccio (Erinaceuseuropeus) ed il restante 7% da specie varie. Leptospira spp è stata isolata da 26 campioni (5,6%); 11 ceppi sono stati isolati da cinghiale, 1 da martora, 9 da muridi, 4 da riccio ed uno da volpe.
Un totale di 451 organi prelevati dalle medesime specie sono stati esaminati con  la PCR utilizzando la coppia di primersLigA e LigB. Sono risultati positivi 62 organi (54 reni e 8 fegati) corrispondenti al 13,7 % dei totali esaminati.E’ stata messa a punto una metodica real-time PCR con l’impiego di primers basati sulla sequenza consenso del gene lipL32; sono stati saggiati 49 reni, il 60% dei quali prelevati da muridi, il 16% da riccio ed il restante 24% da specie varie. Positività è stata evidenziata in 5 reni (10%) di cui 3 di riccio, 1 di martora ed uno di ratto (Rattusrattus). L’analisi MLST (Multilocussequencetyping) e MLVA (Multiple-Locus Variablenumber tandem repeat Analysis) degli isolati dal cinghiale hanno riportato un identico profilo molecolare, identificandoli tutti come Leptospira interrogans serovar pomona; 2 ceppi isolati da ratto sono stati identificati come L. borgpetersenii serovar ballum/castellonis, un terzo isolato è risultato invece L. interrogans serovar hebdomadis. Uno dei tre isolati dal riccio è risultato una L. borgpetersenii  serovar ballum/castellonis. L’unico ceppo proveniente dalla volpe è stato tipizzato come L. interrogans  serovar bratislava.Gli alti livelli di contaminazione e l’ampia diffusione ambientale, stanno ad indicare una ingente circolazione di leptospire spp. nel territorio sardo, aumentando il rischio di esposizione alla malattia sia da parte dell’uomo che di molti animali che vivono allo stato brado nelle aree rurali. La cattura di ratti mediante posizionamento di trappole in prossimità di aziende, allevamenti, canili etc. permette un monitoraggio, seppur limitato, della diffusione e contaminazione di queste aree da parte di piccoli roditori, fra i maggiori responsabili della emissione di leptospire nell’ambiente. La sorveglianza, il controllo e la prevenzione delle malattie dei selvatici costituiscono elementi chiave del management della salute della popolazione umana ed animale nell’ottica di “una sola salute”  One world - Onehealth. 

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