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RICERCHE ministeriali - Anno 2004

Titolo Progetto:
Studio di un protocollo operativo con l'utilizzo di metodiche diagnostiche innovative, per il controllo delle mastiti causate da microrganismi del genere Pseudomonas in allevamenti bovini e ovini munti meccanicamente

N. identificativo: IZS SA 001/2004
Responsabile:
Dr. Liciardi Manuele
razionale del progetto 6

La direttiva 92/46/CEE del 16 Giugno 1992 recepita con DPR n° 54 del 14/01/1997, stabilisce le norme igieniche e sanitarie per la produzione e la commercializzazione del latte. In Sardegna , al fine di adeguarsi a tale normativa, numerose aziende ovine, anche a seguito delle agevolazione esistenti, hanno adeguato o stanno per adeguare le loro strutture con l'impianto di mungitura meccanica già in uso negli allevamenti bovini da latte. L'utilizzo della mungitrice meccanica in assenza di esperienza ed istruzione adeguata degli operatori, può dare origine a gravi problemi ( Pazzona A ., Manuale tecnico per la mungitura meccanica e la refrigerazione del latte ovino e caprino, ERSAT ; La mastite bovina, Current Concepts ,National Mastitis Council; Coni V.,Liciardi M., et al , Mastiti e mungitura meccanica in Sardegna, Atti XIII Congresso nazionale S.I.P.A.O.C-Palermo 16/19 aprile 1998 ) , come l'insorgenza e la diffusione di mastiti da germi ambientali( Howell D. Survey on mastitis caused by environmental bacteria Vet Rec.1972 Jun 3;90(23):654-7.) , in particolare causate da microrganismi del genere Pseudomonas . Gli inconvenienti sono di ordine sanitario per l'alta incidenza di mastiti infettive ed economico per l'aumento dei capi da riformare e che vengono a morte. Si verifica infatti diminuzione della produzione, scadente qualità del prodotto e aumento delle spese sanitarie( Ranucci S. -Mastiti ovine e loro influenza sulle caratteristiche quali-quantitative della produzione lattea. Atti seminario “ Il latte ovino e il mercato: produzione,, tecnologie e commercializzazione” Perugia, 20 novembre 1992, 87-102. ) . Il genere Pseudomonas in particolare può provocare, in bovini ed ovi caprini, mastiti ( McLennan MW, Kelly WR, O'Boyle D. Pseudomonas mastitis in a dairy herd Aust Vet J.1997 Nov;75(11):790-2; Las Heras A, Dominguez L, Lopez I, Fernandez-Garayzabal JF. Outbreak of acute ovine mastitis associated with Pseudomonas aeruginosa infection Vet Rec. 1999 Jul 24;145(4):111-2; Clements AC, Taylor DJ, Fitzpatrick JL. Evaluation of diagnostic procedures for subclinical mastitis in meat-producing sheep.J Dairy Res. 2003 May;70(2):139-48 ) caratterizzate da quadri clinici molto variegati , potendosi osservare mammelle con le sole alterazioni dei caratteri organolettici del latte e tumefazione dei linfonodi sopramammari, processi acuti fino ad arrivare a quadri molto gravi come la mastite gangrenosa e all'exitus ( Crossman P J, Hutchinson I. Gangrenous mastitis associated with Pseudomonas aeruginosa Vet Rec. 1995 May 27; 136(21):548 30;28(4),385-390; Cutler KL. Gangrenous mastitis in dairy herds Vet Rec. 2003 Nov 15; 153(20):635 .).

In particolare in questi ultimi anni sono sensibilmente aumentati i casi di tale patologia nell'ambito dell'intero territorio regionale, sia in allevamenti bovini che in allevamenti ovini ( Ruiu A., Liciardi M et al “ Esperienza nel controllo di una patologia emergente: le mastiti da Pseudomonas spp”Giornata di aggiornamento professionale per veterinari ASl e ARA- Paulilatino –OR– 14/09/2004). Nell'isola , si è passati da 79 allevamenti bovini ed ovini risultati positivi a questa infezione nel corso 2000, ai 120 del 2003; in questi allevamenti, oltre alla perdita di molti animali per morte o per riforma si è dovuto sospendere la mungitura meccanica e ricorrere alla mungitura manuale, con le difficoltà e i disagi facilmente comprensibili . Talvolta in questi allevamenti , tutti dotati di mungitrice meccanica, la situazione sanitaria può essere conseguenza di attività poco accorte se pure involontarie dello stesso allevatore. Di solito infatti le pecore colpite da mastite acuta sono curate con antibiotici per via parenterale senza il preventivo isolamento dell'agente eziologico coinvolto e riammesse alla mungitura dopo che i caratteri organolettici del latte appaiono normalizzati; il reinserimento di un animale infetto, anche se asintomatico o paucisintomatico ma eliminatore di batteri patogeni resistenti agli antibiotici, determina una più agevole propagazione dell'infezione tra gli animali (Coni V.,Liciardi M., et al, Mastiti e mungitura meccanica in Sardegna, Atti XIII Congresso nazionale S.I.P.A.O.C-Palermo 16/19 aprile 1998) .

A tale proposito si ritiene necessario ed urgente studiare ed approntare un protocollo operativo,anche con l'utilizzo di metodiche diagnostiche biomolecolari innovative, finalizzato alla profilassi e al risanamento degli allevamenti nei confronti delle mastiti causate da microrganismi del genere Pseudomonas . Infatti i problemi che devono essere affrontati in un allevamento da latte interessato da questo tipo di mastiti, sono molteplici e complessi, differenti da quelli che si verificano nel corso di mastiti da agenti mastidogeni primari. Di conseguenza, altrettanto differenti sono le modalità di intervento che devono essere attuate nel corso di mastiti da germi ambientali: per l'impossibilità ad attuare efficaci terapie antibiotiche, che anzi producono spesso il selezionarsi e quindi il diffondersi di ceppi particolarmente resistenti, e per l'impossibilità di allestire vaccini. Quindi gli unici interventi possibili risultano essere un' efficace azione di profilassi sanitaria per prevenire l'instaurarsi ed il diffondersi di tali infezioni e, soprattutto in caso di mastiti già in atto, la tempestiva individuazione dei soggetti infetti, ancorché asintomatici e la loro successiva esclusione dalla mungitura meccanica . In ultima analisi si deve garantire che siano destinati alla mungitura meccanica solo animali con emimammelle sane , impedendo in tal modo il diffondersi del contagio.

A tale scopo sarà predisposto un protocollo operativo che, mediante l'utilizzo e l'integrazione di diverse procedure diagnostiche e di intervento, sviluppi un'efficace azione di prevenzione in greggi ancora sani e porti ad ottenere il risanamento di allevamenti già colpiti . Il protocollo operativo si baserà sui seguenti punti:

  • Aggiornamento e formazione continua degli operatori addetti all'allevamento ed in particolare alla mungitura, in funzione delle differenti situazioni epidemiologiche
  • Controllo della carica batterica infettante: lettiera, locali di transito, sala mungitura,acqua utilizzata per la mungitura, mungitrice meccanica
  • Individuazione dei capi infetti, compito non agevole e particolarmente impegnativo per il laboratorio oltre che per l'allevatore, che verrà effettuato mediante: i) visita clinica standardizzata, ii) esecuzione del CMT (California mastitis test) in allevamento, conteggio CCS ( Conta delle cellule somatiche ) in laboratorio mediante metodo fluoro-opto-elettronico , iii) esame colturale dei campioni di latte con CMT positivo, iiii) utilizzo della diagnostica biomolecolare PCR real time, con la progettazione di sonde fluorescenti di tipo TaqMan ad elevata sensibilità, costituite da un frammento di DNA complementare ad una sequenza specifica per il genere Pseudomonas ; con tale metodica è possibile processare 96 campioni in un'ora e si intende abbreviare i tempi per l'individuazione dei capi infetti evitando di esaminare con esami colturali numerosi campioni di latte che richiederebbe due tre giorni di tempo .

I ceppi di Pseudomonas isolati saranno studiati e classificati in base a differenze del potere patogeno attraverso l'analisi dell'espressione genica di proteine del batterio coinvolte durante l'infezione a livello mammario. Per permettere accurate analisi dei dati il latte sarà raffreddato immediatamente, centrifugato e il sedimento batterico conservato congelato. Dopo la lisi batterica, la retrotrascrizione con primer random il livello di espressione genica sara' studiato su un numero selezionato di geni. Verranno presi in considerazione, oltre allo standard gyrB, alcuni dei regolatori di quorum sensing quali lasR e rhlR, il regolatore algR che controlla sintesi dell'alginato e del lipopolisaccaride e alcuni geni di virulenza quali lasA, aprA, exoU e toxA. I risultati attesi dovrebbero permettere di caratterizzare alcune peculiarita' della mastite da Pseudomonas rispetto ad altre e piu' studiate, patologie dello stesso organismo.



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