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RICERCHE ministeriali - Anno 2001

Titolo Progetto:
Produzione di proteine ricombinanti di Mycoplasma agalactiae a scopo vaccinale

N. identificativo: IZS SA 006/2001
Responsabile:
Dr. ssa Tola Sebastiana
razionale del progetto 50

L'agalassia contagiosa è una sindrome che colpisce i piccoli ruminanti ed è caratterizzata principalmente da mastite e secondariamente da artrite e cheratocongiuntivite. L'agalassia contagiosa fece la sua comparsa in Sardegna nel 1980 in seguito all'introduzione di ovini portatori-eliminatori provenienti dalla Sicilia. In pochi anni la malattia ha colonizzato quasi tutta l'isola provocando danni economici molto rilevanti, quantizzati in circa 10-15 miliardi/annui.

La diffusione dell'agalassia contagiosa è dipesa da una serie di motivi legati, in prima istanza, all'alto numero di capi ovi-caprini presenti in Sardegna (3.5 milioni di capi, circa 1/3 del patrimonio nazionale) e all'altissima densità di animali/Km 2 (149/km 2 contro i 23/Km 2 del resto d'Italia); in seconda istanza, alle caratteristiche strutturali dell'allevamento ovino in Sardegna ( pascolo brado, transumanza, abigeato ) e infine, in terza istanza, alla inadeguatezza delle misure di polizia veterinaria, diagnostiche e profilattiche.
Per migliorare le tecniche diagnostiche e i presidi immunizzanti, l'Istituto Zooprofilattico della Sardegna ha realizzato un laboratorio di ricerca con personale altamente competente nel settore delle biotecnologie e del DNA ricombinante. In pochi anni, anche grazie all'apporto finanziario del Ministero della Sanità (Ricerca Finalizzata 1993) è stato messo a punto un sistema diagnostico basato sulla Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) in grado di evidenziare la presenza del M. agalactiae nel latte ovino in sole 5 ore contro i 5-7 giorni del tradizionale esame colturale (Tola et al., (1994) Vet. Microbiol. 41: 335-361; Tola et al. (1996) Vet. Microbiol. 51: 77-84; Tola et al., (1997) Vet. Microbiol. 54: 17-22 ). Risultati molto interessanti si sono anche conseguiti nella caratterizzazione genetica e proteica sempre del M. agalactiae ( Ricerca Finalizzata 1995). Infatti, utilizzando la Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), si è dimostrato che in Italia circola un solo clone genetico di M. agalactiae . (Tola et al., (1996) FEMS Microbiol. Letters 143: 259-265); mentre l'analisi degli antigeni di membrana del M. agalactiae ha permesso di evidenziare 6 principali immunodominanti del peso molecolare di 30, 32, 35, 55, 70 e 80 kDa. (Tola et al., (1997) FEMS Microbiol. Letters 154:155-362).
In particolare, le proteine di 80 e 55 kDa sono lipoproteine fortemente immunogeniche e sono presenti fin dai primi stadi d'infezione. Successivamente, grazie al supporto finanziario della Ricerca Corrente 1996, si è analizzato l'effetto di 5 inattivanti (fenolo, formolo, calore, ipoclorito di sodio e saponina) sulle proteine immunogeniche. Le 5 brodocolture di M. agalactiae sono state somministrate a campioni di pecore e sono stati analizzati l'andamento e la qualità della risposta immunitaria mediante ELISA ed immunoblotting: solo le pecore vaccinate con micoplasmi inattivati con saponina e fenolo hanno resistito all'infezione sperimentale [ Tola et al., (1999) Vaccine 17 (22):2764-2768 ] .

Con questo progetto intendiamo fare il passo successivo: isolare e caratterizzare le proteine immunodominanti del M. agalactiae allo scopo di approntare un vaccino costituito, anzichè dal corpo batterico in toto , da subunità o da proteine ricombinanti. In particolare modo abbiamo deciso di mettere a punto il sistema partendo dalle proteine P80 e P55 che rappresentano le principali proteine immunogeniche del M. agalactiae e di mettere a confrontare la risposta immunitaria di campioni di pecore in seguito all'introduzione della proteina nativa, della proteina ricombinante o dei plasmidi contenenti i differenti geni. Con i vaccini così fatti, speriamo di ottenere una risposta più specifica e più duratura di una brodocoltura inattivata



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